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蛋白質(zhì)含量測(cè)定中有效的四種方法

更新時(shí)間:2019-04-28      點(diǎn)擊次數(shù):3599
蛋白質(zhì)含量測(cè)定是指通過(guò)物理或化學(xué)方法對(duì)蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。蛋白質(zhì)是構(gòu)成人體細(xì)胞和組織的重要成分,蛋白質(zhì)含量測(cè)定是生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究中常用、基本的分析方法之一。人體正常值一般是 60~80 g/L,準(zhǔn)備待測(cè)蛋白質(zhì)溶液,如血清蛋白等,用蒸餾水稀釋蛋白質(zhì)溶液;如為固體蛋白質(zhì),應(yīng)在105℃環(huán)境下烘干。
蛋白質(zhì)含量測(cè)定的操作方法
1.凱氏定氮法
準(zhǔn)備4個(gè)50mL凱氏燒瓶并標(biāo)號(hào),想1、2號(hào)燒瓶中加入定量的蛋白質(zhì)樣品,另外兩個(gè)燒瓶作為對(duì)照,在每個(gè)燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物,再加入濃硫酸,將4個(gè)燒瓶放到消化架上進(jìn)行消化,之后進(jìn)行蒸餾,全部蒸餾完畢后用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量,直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色,即為滴定終點(diǎn),結(jié)算出蛋白質(zhì)含量。
2.雙縮脲法
雙縮脲法是個(gè)用比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法,硫銨不干擾顯色, Cu2+與蛋白質(zhì)的肽鍵,以及酪氨酸殘基絡(luò)合,形成紫藍(lán)色絡(luò)合物,此物在540nm波長(zhǎng)處有大吸收。首先利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液和雙縮脲試劑繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將待測(cè)血清與硫酸鈉在待測(cè)試管中混合,并用只加入硫酸鈉不含血清的試管作為對(duì)照,將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑,充分混合后于37℃環(huán)境中放置10分鐘,在540nm波長(zhǎng)進(jìn)行比色,以對(duì)照管調(diào)零,讀取吸光度值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接查出蛋白質(zhì)含量。雙縮脲法常用于0.5g/L~10g/L含量的蛋白質(zhì)溶液測(cè)定。
3.酚試劑法
取6支試管分別標(biāo)號(hào),前5支試管分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,后一支試管加待測(cè)蛋白質(zhì)溶液,不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,每支試管液體總量通過(guò)加入蒸餾水補(bǔ)足而保持一致,將液體混合均勻,在室溫下放置30分鐘,以未加蛋白質(zhì)溶液的支試管作為空白對(duì)照,于650nm波長(zhǎng)處測(cè)定各管中溶液的吸光度值
4.紫外吸收法
大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)處有特征的大吸收,這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸存在,可用于測(cè)定0.1~0.5mg/mL含量的蛋白質(zhì)溶液。取9支試管分別標(biāo)號(hào),前8支試管分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,1號(hào)試管不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,后一支試管加待測(cè)蛋白質(zhì)溶液,而不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,每支試管液體總量通過(guò)加入蒸餾水補(bǔ)足而保持一致,將液體混合均勻,在280nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色,記錄吸光度值。
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